蛋白質(zhì)是構(gòu)建生命體的基本物質(zhì)之一，在合成、催化和信號(hào)傳感等所有生命活動(dòng)中均承擔(dān)著重要的功能。開(kāi)發(fā)一種可靠、高效的蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)對(duì)于理解生命過(guò)程和揭示疾病機(jī)理而言至關(guān)重要。作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的組成片段，多肽，成為打開(kāi)蛋白質(zhì)這扇大門(mén)的“鑰匙”。

納米孔測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)新興的一種單分子測(cè)序技術(shù)，其中多肽納米孔測(cè)序仍面臨諸多挑戰(zhàn)。近日，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名期刊《納米快報(bào)》雜志發(fā)表論文，他們利用納米孔錯(cuò)位測(cè)序技術(shù)，像在水井里提繩打水一樣，構(gòu)建了多肽-DNA嵌合鏈，用DNA測(cè)序酶與DNA的結(jié)合，通過(guò)DNA的移動(dòng)，帶動(dòng)多肽分子在納米孔內(nèi)的棘輪運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)了多肽的納米孔測(cè)序，破解了技術(shù)瓶頸。

無(wú)法進(jìn)行序列擴(kuò)增，制約蛋白質(zhì)測(cè)序靈敏度

蛋白質(zhì)，組成人體一切細(xì)胞、組織的重要物質(zhì)，可以說(shuō)，沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。而蛋白質(zhì)的功能是由蛋白質(zhì)的序列決定的，序列的微小改變，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去生物活性或者誘發(fā)疾病。

如果能為蛋白質(zhì)測(cè)序，就可以確定蛋白質(zhì)是否有序列變化，判斷是否會(huì)對(duì)人類(lèi)健康有影響。

“與核酸檢測(cè)不同，目前蛋白質(zhì)測(cè)序的難點(diǎn)在于，缺乏有效的序列擴(kuò)增方法，技術(shù)發(fā)展上停滯不前，主要靠質(zhì)譜法和埃德曼降解法來(lái)測(cè)序。”該篇論文的通訊作者、南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院教授黃碩說(shuō)。

通俗地說(shuō)，質(zhì)譜法是用生物酶將蛋白質(zhì)分解成很多多肽片段，再通過(guò)質(zhì)譜儀器檢測(cè)，確定蛋白質(zhì)片段的信息，最終將這些片段重構(gòu)成蛋白質(zhì)序列。而埃德曼降解法是用化學(xué)方法將蛋白質(zhì)N端的一個(gè)氨基酸切下來(lái)進(jìn)行鑒定，再進(jìn)行第二輪的氨基酸切割和鑒定，多次循環(huán)操作后，確定氨基酸的序列。

但在黃碩看來(lái)，這兩個(gè)方法都有局限性。“相較于DNA和RNA測(cè)序，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)更多，質(zhì)譜法的檢測(cè)難度大于核酸測(cè)序。而對(duì)埃德曼降解法來(lái)說(shuō)，它只能對(duì)單一的蛋白質(zhì)樣品序列解析，如果降解的樣品純度不夠，混合有多種蛋白質(zhì)樣品，那么被切下來(lái)的氨基酸就會(huì)有很多種，就無(wú)法確定哪個(gè)氨基酸來(lái)自哪個(gè)蛋白質(zhì)的，無(wú)法判斷蛋白質(zhì)的序列。另外，還有一些肽段的末端是封閉的，就不能用降解法?！秉S碩介紹。

更重要的是，由于無(wú)法實(shí)現(xiàn)序列擴(kuò)增，蛋白質(zhì)測(cè)序的靈敏度度較低，這意味著無(wú)法檢測(cè)自然界中一些豐度很低的蛋白質(zhì)樣品。黃碩認(rèn)為，利用現(xiàn)有的技術(shù)，復(fù)雜環(huán)境中的蛋白質(zhì)，難以直接測(cè)序，比如體液、土壤、水體中的蛋白質(zhì)樣品，要先做一些純化、富集，達(dá)到測(cè)序的樣品標(biāo)準(zhǔn)，才能在質(zhì)譜儀中測(cè)序。同時(shí)，蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾很豐富，這也有可能干擾蛋白質(zhì)測(cè)序。

借助DNA與酶的反應(yīng)，牽引肽鏈在納米孔中可控運(yùn)動(dòng)完成測(cè)序

能不能找到一種更微觀的測(cè)序方式，只用一個(gè)分子就能為蛋白質(zhì)測(cè)序？從2015年開(kāi)始，納米孔測(cè)序技術(shù)進(jìn)入黃碩課題組研究視野。

納米孔測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)新興的一種單分子測(cè)序技術(shù)，已在DNA和RNA測(cè)序方面取得成功，它通過(guò)讓單鏈的核酸通過(guò)納米孔，通過(guò)納米孔內(nèi)的檢測(cè)器獲得核酸鏈的堿基信息。

“如果能在單分子水平上為蛋白質(zhì)測(cè)序，將為檢測(cè)低豐度蛋白和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提供極高的靈敏度。”受此啟發(fā)，黃碩課題組開(kāi)始研究，用納米孔測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行蛋白質(zhì)或多肽的單分子測(cè)序。

但是多肽納米孔測(cè)序仍面臨諸多挑戰(zhàn)，其中一個(gè)主要的困難是如何實(shí)現(xiàn)多肽在納米孔中可控的棘輪運(yùn)動(dòng)，而這主要受限于目前沒(méi)有和肽鏈相匹配、有很強(qiáng)的親和力的多肽測(cè)序酶。

“棘輪運(yùn)動(dòng)指的生物高分子貼著納米孔的內(nèi)壁，順著同一個(gè)方向做勻速、定向運(yùn)動(dòng)，類(lèi)似于附著在齒輪內(nèi)壁上移動(dòng)一樣，這需要找到一種酶來(lái)控制多肽的運(yùn)動(dòng)速度，從而控制它穿過(guò)納米孔的速度，以精準(zhǔn)測(cè)序?！?/p>

此前，黃碩課題組曾嘗試對(duì)非天然核酸測(cè)序，但是苦于沒(méi)有找到合適的酶來(lái)匹配棘輪運(yùn)動(dòng)，后來(lái)，他們突發(fā)奇想，利用納米孔的錯(cuò)位效應(yīng)來(lái)測(cè)序，并開(kāi)創(chuàng)了納米孔錯(cuò)位測(cè)序技術(shù)。

“核酸的納米孔識(shí)別位點(diǎn)和酶的反應(yīng)位點(diǎn)，有一個(gè)固定的約14-15個(gè)堿基的錯(cuò)位，這就形成了一個(gè)測(cè)序窗口，可以利用這個(gè)不受酶反應(yīng)限制的窗口，實(shí)現(xiàn)多肽的測(cè)序?！秉S碩說(shuō)。

納米孔錯(cuò)位測(cè)序技術(shù)能否應(yīng)用在多肽測(cè)序領(lǐng)域？近期，黃碩課題組在技術(shù)驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)可行。在此次研究中，他們將多肽和DNA嵌合成一條鏈條，嵌合鏈的DNA部分為“牽引鏈”，在檢測(cè)過(guò)程中，DNA測(cè)序酶與DNA結(jié)合，通過(guò)拉動(dòng)DNA部分，牽動(dòng)整條鏈條在納米孔中的可控棘輪運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)多肽的納米孔直接讀取。

黃碩打了個(gè)比方，“這就相當(dāng)于用繩子在井里提水桶，如果井是納米孔的話(huà)，井繩就是DNA，水桶就是多肽?！凇腄NA測(cè)序酶拉動(dòng)DNA在納米孔內(nèi)移動(dòng)，而DNA又與多肽嵌合在一起，DNA的移動(dòng)，也就直接拉動(dòng)了多肽的移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)了多肽的納米孔測(cè)序。”

黃碩介紹，經(jīng)驗(yàn)證，多肽的納米孔測(cè)序信號(hào)表現(xiàn)出高度的一致性和序列相關(guān)性，由單氨基酸替換引起的電流變化也能被清楚地檢測(cè)到。通過(guò)將多肽的N端或C端與DNA驅(qū)動(dòng)鏈進(jìn)行偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多肽兩端氨基酸序列信息的讀取。

“這意味著，可以對(duì)蛋白質(zhì)單分子進(jìn)行測(cè)序，這為今后的蛋白質(zhì)高通量測(cè)序，蛋白質(zhì)重構(gòu)，提供了一個(gè)全新的工具?！秉S碩說(shuō)，借助蛋白質(zhì)序列研究，可以對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而幫助理解、解釋相關(guān)生命活動(dòng)。